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    公开号:WO1984002350A1
    申请号:PCT/JP1983/000427
    申请日:1983-12-05
    公开日:1984-06-21
    发明作者:Sigeru Chiba
    申请人:Toushou Denki Co Ltd；
    IPC主号:C12N1-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 超音波破砕装置 技術分野
    [0002] 本発明は超音波破碎装置に係わ り 、 更に詳 し く は 、 細胞の細胞膜を破降 し て、 細胞内 の 小器官 を 分別す る 為 に用 いる 細胞破降装置に お い て用 い る 容器、 即ち 破 ^すべき細胞の 溶液を収容せる 容器に特徵を 有す る 超 音波破砕装置に関 す る 。
    [0003] 背景技術
    [0004] 近時、 医学臨床検査、 遺伝子工学等の分野に於い て 細胞内 の各 器官 の化学組成や生物学的特性 を調べる た め に 、 細胞膜を破降 し細胞内の小器官 を 分別 する 方法 が さ か んに行な わ れ てい る 。 例えば、 臨床検査の上で 赤血球、 白血球の 内 液の生化学的解析を進め る 等の為 に広 く 行な われ てレ、 る 。 こ の為 に細胞等の超音波に よ る 破碎装置が甩 い ら れて い る が、 従来は 発振器 と 、 振 動子 と 、 ホ ー ン 又は チ ッ プよ り 成 り 、 洌えば血 液 よ り 遠心分離 し て得た赤血球含有液を収容せ る ビー カ ー又 は 試験管中に 、 ビ ー カ ー又は 試験管の上部か ら 上記の ホ ー ン 又は チ ッ プを 浸漬 し 、 そ の状態 で発振.器の 出力 に よ り 振動子を励振 し ホ ー ン を介 し て容器中 の赤血球 に超音波振動を加 え 、 キ ヤ ビ テ ー シ ヨ ン現象等 を生ぜ し め て赤血球等の細胞膜を破砕す る 装置であ る 。 こ の 従来装置は 、 多量の細胞等の被破砕 ^ を容器に満 し 、 それ ら被破 ^阵に ホ ー ン よ り 一様な超音波：^動 を ϋΠ え る の で、 一度に多量の破降を 可能にす る が、 眩面に お いて、 従来型の場合 、 ホ ー ン を 容器に挿人 し た ま ま と な る の で、 容器を 開口状態に保つ必要があ り 非密閉 溝 造であ る か ら 、 有毒性な被破 ^体を処埋する 場合、 超 音波処理に よ つ て被破 钵が エ ア ゾー ル化 し 、 多部に 飛散す る おそれがあ り 検査者 · 研究者に と つ て好ま し い こ と では な い。 又被破 側か ら みた場合に於い て も 、 容器が非密閉溝造で あ る と 、 外部の細菌、 微生物 に よ っ て汚染 さ れる 場合があ り 、 ^胞破 ^に よ っ て得 ら れる ^胞小 器官 を純粋な状態に保持で き ず、 目的 と する 研究に 支障を来す おそれがあ る 。 又 、 上記の よ う に非密閉溝造であ つ て細胞等被破降 内に含 ま れて い る 水分が ii ffi され易い の で、 の変化を生 じ易 く 、 所菊の破 ^洁果が得 ら れ な い場合が多い。 列 えば、 臨 床 .漠査の上で赤血球、 白血球の内 液の生化学的； 析に 於い ては 水分の癩 や P Η の変化を で き る だけ避けな ければな ら な いが、 ^来 の も の は そ の要請に十分答え ていな か っ た。 更に 、 細胞分画法に於い ては細胞破壊 に よ っ て生 じ た 液、 即 ち 細胞小器官が？ 濁 し た 夜を 遠 心分離機に かけて （固 々 の細胞小器官に 分け る も の であ る が こ の ^ ^来は 非密閉 溝造の 谷 な の で 、 也の容器 に分注 し 、 それか ら 遠心分離機に かけ ていた。 従 っ て
    [0005] f乍業効率が悪か っ た 。 又容 ^中に満た さ れている 夜の
    [0006] O PI 温度は 、 超音波振動 の β播性や細胞等被破砂 ^ 自 体の 変化に対 し大 き な関連性 を 有 し 、 処埋操作に於い て 液 温の適切な菅理が望ま れ る 所で あ る が、 従来型の場 合 に は 容器の外か ら 液を冷却 し て 液温を 剷 卸す る こ と と な る の で、 そ の制 卸がむずか し く 管理が大変で あ つ た 。
    [0007] 従 っ て 、 例 え ば超音波振動 の 沄播性は 液温が fi:い裎 良 く 、 又大部分の被破 体は ©温で保存 さ れ て い る 為 、 破 ^処理の 設階でそれ よ り か な り 高い温度 下に さ ら さ れる と 熱的変化を生 じ所期 の破降結果が得 ら れな い の で、 こ れ ら の場 合には 夜温 を常に 冷却す る こ と と な る が、 従来型は 容器の外 よ り 冷却 す る の で 、 意図通 り に 冷却で き な か つ た o
    [0008] 更に ¾来型の装 Λは 、 上述 し た よ う に I司種の 被破 体の多纛 を I司時に ^晬す る に 適 し てレ、 る 反 面 、 1重 々 の 被破 ^ ^を 効率的に破 す る に は 適 し てレ、 な レ、 o
    [0009] 本発明は こ れ ら の点に鑑み成 さ れた も の で、 そ の 目 的 と す る 所は 、 ^胞を 波 す る に ^ し 、 ^胞を 密閉状 に保持で き る よ う に す る に あ る 。 それに よ り 研究者 、 作業者の 安全性を 可能に す る と 共に 、 破 ^に よ っ て得 ら れる 細胞小 器官 を 外部の細菌ゃ微生物に よ る 汚染か ら 守る よ う に す あ ο つ破 ^中に お け る ^胞の 変化を 極力抑制 で き る よ う に す る に あ る 。 又超音波振 動が ¾播す る 槽の 夜温を 直接的に菅埋 で き る よ う に す る に あ る 。 そ れに よ り 超音波振動の fe播性等に大 き な 影響を も つ 液温 の管埋を 容易 と す る に あ り 、 更に多種 の細胞を効率的に破降する に好適 と す る に あ る 。 且つ
    [0010] 細胞破降を し た後に 、 そ の ま ま 、 他の 容器に分注する こ と な く 細胞分画法に お ける 遠心分離機操作が可能で あ っ て 、 作業効率の よ い容器を提供す る に あ る 。
    [0011] 明の 1示
    [0012] 即 ち 本発明は 、 破 ^すべ き ^胞の 溶夜を収容せる 容
    [0013] 器を漕の 夜中に垂直態様に て浸漬せ し め 、 漕の底部 よ り 超音波を 発振せ し め て、 上記容 内 の細胞を 破砕す る よ う に し た装蘆にお いて 、 上記容 ^は 、 有底円筒状
    [0014] の金属製 チ ブ と 、 こ の金 製 チ ュ ー ブの 内周面に 密接す る 部分 と 、 その外周に取着 さ れた 0 リ ン グ よ り 或 り 、 上記金禺製 チ ブ の 開口 部 を 密封する キ ヤ ッ ブ と 、 上記 キ ャ ッ プの 中央に 支持 さ れて い る と 共にそ の先端 と チ ブ底部 と の間に僅かな間邋を存 し た態 様で金潙 チ ブ内に垂下 さ れる 金属捧 よ り ^る こ と を 待徵 と す る 超音波細胞破 ^装置で あ る 。 こ れに よ り 、 細胞の破踭する に傺 し 、 細胞を密閉状態 に ^持で き 、 作業の 安全性を 可能に す る と 共に 、 破 ^ さ れた細 胞小 官 を外部の汚染か ら 守 り 、 且つ破 ^中におけ る 細胞の変化を 極力抑制で き る 。 又超音波振動が 沄播す る 樓の 液温を 直 1¾的に菅埋で き る の で 、 夜温の管理を 容易に行 う こ と がで き 、 超音波振動の &播性を よ り よ い も の に す る こ と がで き る。 更に少量多瘇の細胞を効 率的に破 で き る 。 又金属製チ ュ ー ブであ り 、 且つ キ
    [0015] ャ グ ブは 歸口 部に £入挿着 さ れ ていた り 、 蟝着 さ れて
    [0016] O PI お り 、 し っ か り と 開口 部に 取 り つ い てレ、 る の で、 万が 一不測に落 し た り 等 し て も 損傷、 破壊す る よ う な こ と がな く 、 耐久性に 富む と 共に極め て安全で あ る 等種 々 の利点 を 有す る も の であ る 。 且つ細胞破 ^ し た後にそ の ま ま細胞分画法に於け る 遠心分離機操作がで き 、 作 棻能率が よ い も の であ る 。
    [0017] 図面 の簡単な 説明
    [0018] 添付図面は 本発明の実 沲咧 を示 し 、 第 1 図.は 装置の 縦断側面図 、 ^ 2 図は苐 1 の 列の 容器の 断面図、 第 3 図は第 2 の ^ の 容 ^の 断面図であ る 。
    [0019] 発明を 実沲する 為 の最良 の形態
    [0020] 本発明を よ り 詳細に 記述す る た め に 、 以下添付図面 に ¾ つ て こ れ を 説明す る 。
    [0021] 1 は 高周波発振器、 2 a 〜 2 d は 高周波発信器 1 に よ り 駆動 さ れ る 励振 コ イ ル 3 が卷着 さ れた フ ェ ラ イ ト 磁歪振動子等 の振動子、 4 は 液 W を 満 し た 漕で あ り 、 以上は ケ ー ス 5 の 中に収容 さ れた超音波 ^胞破 ^置 で あ る 。 本発明は 、 こ の よ う な超音波破 ^装置に甩 ぃ ら れる 容器 A に係わ り 、 先ず第 2 ®に よ り 桌一の 例 を 説明す る 。 容器 A は 有底円筒状の金属性 チ ュ ー ブ 6 と 、 金属性チ ュ ー ブ 6 の 開口 ^ 7 を 密閉す る キ ヤ ッ ブ 8 と 、 キ ヤ ツ プ 8 の 中央に支持 さ れた金靄棒 9 よ り 成る 。 即 ち 上記金属性 チ ュ ー ブ 6 は ス テ ン レ ス 製 で あ り 、 そ の 開口 部 7 の頂緣が外方に折曲せ し め ら れ て フ ラ ン ジ 10
    [0022] を 形成 し て レ、 る 。 そ し て キ ャ ッ プ 8 は 、 金属製 チ ュ ー
    [0023] OMH ブ 6 の 開□ 部 7 内に挿入せ し め ら れる 小径部 11 と 、 開 口 部 7 外の フ ラ ン ジ 10 上に座す大径部 I2 よ り 或 り 、 上 記小径部 11 に 0 リ ン グ が卷着 さ れて い る も の であ る 。
    [0024] ^ つ て、 金属製チ ュ ー ブ 6 の I口部 7 は小径部 の周 り の 0 リ ン グ と 、 フ ラ ン ジ 10 上に座す大径部 I2 'の双 方に よ っ て密閉が ^ ら れ て いる 。 更に金虜棒 9 は 、 キ ヤ ッ プ 8 に対 し 次の よ う に取付け ら れて レ、 る 。 即ち 、 キ ヤ ッ ブ 8 の 中央の穴に金羼捧 9 が遺 さ れ、 金属俸 9 の上部に形或 さ れた雌ネ ジ I4 に ナ ッ ト が蟝着せ し め ら れ、 その ナ ツ ト を締付 ^定す る こ と に よ っ て垂下 支持 さ れて い る も の であ る 。
    [0025] 次に こ の よ う な 溝成の 容器 A の ^い方を 説明する 。 先ずキ ヤ ッ ブ 8 を外 し 、 金属襄 チ ュ ー ブ 6 内に破 ^ すべき細胞を 含ん だ溶液 T を収容する 。 次いでキ ヤ ッ ブ 8 を冠す る 。 即ち 小径部 11 を 開口 部 7 に £人挿着 し 、 大径部 I2 を フ ラ ン ジ 10 上に垒す。 こ れに よ り 、 0 リ ン グ 13 が金 製 チ ュ ー ブ 6 の 内周面に密着 し 、 且つ大逢 部 I2 の底面が フ ラ ン ジ 10 上に座 し てい る こ と に よ り 、 金属製 チ ュ ー ブ 6 内 の密閉が図 ら れる 。 そ し て 、 こ の キ ャ ッ プ 8 の装着に よ り 、 金属棒 9 が、 そ の先端 IS を 底部 と の ^に 1≤かな間 ^を存 し た態 ^で垂下支持 さ れ、 細胞を溶か し た溶液中にその先端 W が位置する 。
    [0026] こ の よ う に準傭を了え た後、 こ れ ら 容器 A の .虔致を 槽 4 に冠せ ら れた装着板 IS の装着穴 IS に セ ッ ト す る 。 それに よ り 各容 A は槽 4 内 の 夜 W 中に垂直惑様に 浸漬せ し め ら れる 。 次い で発振器 i を駆動 し 、 励振 コ ィ ル 3 の励振を介 し て磁歪振動子 2 を 振動せ し め 、 超 音波を放射面か ら 放射 さ せる 。 放射 さ れた超音波振動 は 液 W 中を 伝播 し て容器 A に 伝わ り 、 細胞の細胞膜を 破 ^す る 。 こ の破砕 メ カ ニ ズ ム を示す と 次の適 り で あ る 。 先ず 、 一つ の破砕作甩は 、 夜 W 中 を β播 し た超音 波振動が密閉容器 Α 中 の細胞に βわ り 、 そ の音 £に よ つ て破 ^す る と レ、 う 点で あ る 。 そ し て 、 も う 一つ の破 降作甩は 、 容器 Α が超音波振動に対 し て共振する よ う な'固有振動绫 を 有す る よ う に 長 さ 、 太 さ 、 全体の形状 等を定め る こ と に よ り 、 超音波振動 を 受け た時、 容 器 A 全 j$を共振せ し め 、 即ち 金属製 チ ュ ー ブ 6 、 キ ヤ ッ ブ 8 及び金虜捧 9 を 共振せ し め 、 金属捧 9 の先端 IS よ り 細胞に対 し超音波振動 を 与え 、 細胞を 溶か し た 溶液 内 に キ ヤ ビテ ー シ ヨ ン 現象を生起 し 、 こ の キ ヤ ビテ ー シ ヨ ン 現象に よ り 、 液に対 し 瞬 ^的な減 £力 と Ϊ縮力 を 交互に ί乍甩 さ せ 、 それに よ り ^ 々 の 細胞の細胞膜が 破 せ し め ら れる も の であ る 。
    [0027] 次に破 ^試 ^ ^ を 参考的に示す。
    [0028] 試験洌 1
    [0029] 1) 試 ^名 大腸菌生菌数 と 破晬処理時間
    [0030] 2)要 旨 大嬝菌生菌数が破 ^処埋に よ っ て 、 ど の よ う に減少 し てい く か を 時間 を 追 っ て測 '3 ^>
    [0031] 3)操 作 大腸菌 （寒天倍養 し た も の） を P B S 中 に浮遊 さ せ、 こ れを 容器に 入れて、 破砕 処理を行な っ た後、 滅菌 ？ B S で適当に 希釈 し て、 大慮菌 if 選択倍地上に一定量 を塗抹する 。 37 で 1 日倍養 し た後 、 シ ヤ ー レ上の コ ロ ニ ー致よ り 原検液の生菌 叙を j£算 3 る ο
    [0032] 破 ^処連は 、 超音波周波数 29 K H Z 、 ¾ 力 1 1 0 W 、 電源 50 y 60 E Z 1 0 0 V の装置を 甩い、 'tff 内 の 液温を 6 TC と し て 実沲 し た。
    [0033] )結 果
    [0034] )考 察 生菌 ^: (対数： Lは ほぽ直镲的に時 に つ れて減少 し てい く こ と が判明 し た。
    [0035] 洌 2
    [0036] ) 試 ^名 大腸菌 D N A 収量 と破砕処逑時間
    [0037] )要 旨 大腸菌の ： D N A 量が破 ^処 ^に よ つ て ど れ埕菌本外に放 ¾さ れる か を時間 を追 つ て測定す る 。
    [0038] )操 作 大 1 菌浮遊液を一定時間破降処理 し た後 超遠 '、 し た上清につ い て、 B u r t o n 法 （ ジ フ エ ニ ル ァ ミ ン に よ る 呈色） で D N A を定量 し 、 時間 を追 っ て比較する 。
    [0039] )結 果 ① 時間 ） 0 10 25 40 皿 1Λ) 28 354-4 394.4 396 試験③
    [0040] 時間 (5¾ 0 10 25 40
    [0041] 70 548 545 553
    [0042] SA, - '^)
    [0043] 時間 (分) 0 2 5 7 頂 ΑΜΛ) 85 530 545 570
    [0044] 5)考 察 試 ^① と ③では ス ケ ー ル を 長 く と っ て行
    [0045] な っ た が、 10 分で も 分で も あ ま り 変 ί匕 が な か つ た の で 、 試験③で 10 分以内 の変 化を みた。 し か し 、 こ れ で も ま だ 2 分 と 7 分 と では あ ま り 変化が見 ら れな か っ た。
    [0046] し た が っ て大腸菌の場合 は 2 分以内に 菌 が破 ^ さ れ 、 中 の ] D が流 出す る こ と がわ か っ た ο そ し て 、 こ れ ら の破 ^過裎に おい て 、 細胞は 密閉容 器 Α 内に密閉 し た状態で破 さ れる の で絀胞が エ ア ゾ ー ル化 し 外部に飛散す る おそれが全 く な い。 っ て危 険な細胞を扱 っ て も 、 研究者、 検査者に と つ て極め て 安全で あ り 、 且つ細胞 自 *に関 し て も 破 さ れた細胞 小器官 を外部の汚染か ら 効果的に守る こ と が で き 、 且 つ 、 水分の漏 ¾及びそれに伴 う Ρ Η の 変化が全 く 生 じ な い の で所期 し た適 り の破 結果が得 ら れ る も の で あ る o PRE
    [0047] OMPI WIPO 更に 、 破 すベ き細胞は 容 A 内に密閉 さ れてい る
    [0048] の で、 禮 4 内 の 液 W を 直接冷却す る こ と がで き る 。 即
    [0049] ち 液温を 下げた ければ、 よ り 廷温の冷却 水等を 直接槽
    [0050] に投入 し 、 液温を 直接調節すれば よ い。 こ の _よ う に 夜
    [0051] 温を容易に調節で き る の で 、 超音波振動の 沄播性を 离
    [0052] め た り 、 細胞 自 の熱的変化を極力防止で き る 。 又容
    [0053] 器 A 自 が小 さ く 、 複教を， ft内 に セ ッ ト で き る の で 、
    [0054] 短時間の 内に幾湩も の細胞を効率 よ く 破 ^で き 、 多锺
    [0055] 少量破 ^に効果を発揮す る も の であ る 。 且つ 、 破降に
    [0056] よ つ て得た細胞小 ^官の懸濁液を 、 その ま ま 遠心分離
    [0057] 操作にかけ ら れる 。 っ て ί固 々 の細胞小器官に 分離す
    [0058] る ί乍業の効率が よ い も の で あ る 。
    [0059] 次に第 3 に従い 、 も う 1 つ の容器の実 ^ ]を 詳述
    [0060] する。 こ の 洌 の碭合有底円筒状の金 桌製 チ ブ 21 の
    [0061] 開口部 22 の外周面に雌 ネ ジ 23 を形成す る 。 也方キ ヤ ッ
    [0062] プ 24 に環状の溝 25 を形 ¾ し 、 該溝 25 に よ っ て区切 ら れ
    [0063] る 内側部分 26 を 銷口 部 22 に揷着で き る 部分 と ^ し 、 他
    [0064] 方外側部分 27 の し¾[面に雄ネ ジ 28 を形或する 。 そ し て 、
    [0065] 内側 ^分 6 の 下 部の ill り に 0 リ ン グ 29 を卷着する と
    [0066] に溝 25 の底に も 0 リ ン グ 30 を装着する 。 そ し て附号 S1
    [0067] は金 俸 を示 し てい ο
    [0068] こ の よ う に す る と 、 細砲を溶か し た 溶夜を金属製チ
    [0069] ブ 21 内 に収容す る に は 、 キ ャ ッ プ 24 を 回 し て、 該
    [0070] キ ヤ ッ プ 2 を 取 り 外 し 、 次いで金属 チ ュ ー ブ 21 内 に
    [0071] 溶夜を収容後、 キ ャ ッ プ 2 の雄ネ ジ 28 を金属製 チ ュ ー
    [0072] ΟΜΡΙ ブ 21 の雌ネ ジ 23 に螺着す れば、 キ ヤ ッ ブ 24 を 開口 部 22 に対 し て し つ か り と 装着で き る 。 こ れに よ り 金属製 チ ユ ー ブ 21 内 を 密封 と する こ と がで き 、 前述 し た実施洌 と 同一の作用 . 効果 を 可能に す る 。
    [0073] - '
    权利要求:
    Claims

    請求の範囲
    破降 すべ き細胞の溶液を収容せる 容器 を槽の 液中に
    垂直葸様に て浸瀵せ し め 、 槽の底部 よ り 超音波を発振
    せ し め て、 上記容器内の細胞を破降する よ う に し た装
    置に お いて 、 上記容器は 有底円筒状の金属製 チ ュ ー ブ
    と 、 上記金属製 チ ュ ー ブ の 内周面に 密接する 部分 と 、
    その外周に 取着 さ れた 0 リ ン グ よ り 成 り 、 上記金属製
    チ ュ ー ブの 開口 部に 対し着脱 自在に装着 さ れる キ ヤ ッ
    プと 、 上記キ ャ ッ プ の 中央に支持 さ れて いる と 共に そ
    の先端 と チ ュ ー ブ底部 と の間に僅かな間隙 を存 し た態
    様で金属製 チ ュ ー ブ内に垂下 さ れる 金属棒 よ り 成る こ
    と を特徵 と する 超音波破砕装置。
    O PI
    、 WIPO
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
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    同族专利:
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    引用文献:
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    法律状态:
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    1984-06-21| AL| Designated countries for regional patents|Designated state(s): AT BE CH DE FR GB LU NL SE |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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